بررسی ژن های موثر در مقاومت به فلزات سنگین و نانو اکسیدهای فلزی در سودوموناس های جداسازی شده و کنترل زیستی آنها توسط آنتاگونیست های میکروبی

با افزایش سطح فلزات در محیط به علت فعالیت های صنعتی و اعمال کشاورزی مدرن، باکتری ها استراتژی هایی را جهت کاهش غلظت درون سلولی آلوده کننده های سمی به روش های مختلف دارا می باشند. بنابراین محیط های آلوده به فلزات سنگین دارای میکروارگانیسم هایی با قابلیت مقاومت در برابر این فلزات هستند. پژوهش حاضر در ارتباط با بررسی ژن های موثر در مقاومت به فلزات سنگین و نانو اکسیدهای فلزی در سودوموناس های ایزوله شده و کنترل بیولوژیکی آنها بوسیل? آنتاگونیست های میکروبی می باشد. در ابتدا 15 سویه از نمونه های خاک و پساب جداسازی شد. هشت سویه بر اساس مقاومت بالا در برابر یون های مس و روی، نانو اکسید مس و نانو اکسید روی غربال گری گردید. سویه ها بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و آنالیز توالی ژن rrna s16 به عنوان سویه های سودوموناس شناسایی شدند. آنالیز ژن rrna s16 نشان داد که %25 سویه ها به سودوموناس پوتیدا، %25 به سودوموناس فلورسنس و %5/12 به سودوموناس آئروژینوزا تعلق دارند. تمام سویه ها به منظور تعیین حضور ژن های مربوط به مقاومت به یون های مس و روی (copa و czcc) مورد بررسی قرار گرفتند. برای این کار ابتدا dna ژنومی استخراج شده و با پرایمرهای اختصاصی طراحی شده برای این ژن ها pcr گردید. در میان سویه های غربال گری شده فقط fluorescens cuo-2 p. و p. putida zn-2 با پرایمرهای استفاده شده در این پژوهش ژن copa و سویه های p. fluorescens strain cuo-1، pseudomonas sp. zno-1، pseudomonas sp. zno-2 و putida zn-2 p. ژن czcc را دارا بودند. جهت تعیین نیمرخ پلاسمیدی باکتری ها، dna پلاسمیدی جداسازی شده و بوسیل? الکتروفورز ژل آگارز مشخص گردید. نتایج نشان داد که %75 سویه های جداسازی شده یک پلاسمید با وزن مولکولی بالا (kb 2/17) را حمل می نمایند، در حالی که سوی? p. putida zn-2 دارای دو پلاسمید می باشد. بیشترین غلظت قابل تحمل هم? سویه ها بر علیه یون های مس و روی، نانو اکسید مس، نانو اکسید روی و برخی از آنتی بیوتیک ها اندازه گیری شد. ارتباط بین مقاومت به فلزات سنگین و نانو اکسیدهای فلزی با مقاومت به آنتی بیوتیک ها با فرض مقاومت به استرس چندگانه در باکتری ها مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز آماری ارتباط مثبتی بین مقاومت به فلزات سنگین، نانو اکسیدهای فلزی و آنتی بیوتیک ها در تمام سویه ها نشان داد. اگزوپلی ساکارید تولید شده توسط سویه های مقاوم به نانواکسیدهای فلزی، استخراج گردیده و اثر محافظتی آنها بر روی سلول ها مورد ارزیابی قرار گرفت. کاهش در میزان اگزوپلی ساکارید بعد از برهم کنش مایع رویی کشت p. fluorescens cuo-1 با نانو ذرات cuo مشاهده گردید. طیف های ft-ir اگزوپلی ساکارید استخراج شده از مایع رویی کشت باکتری و نانو ذرات cuo بر هم کنش داده با اگزوپلی ساکارید، تقریباً مشابه بود. پوشانده شدن نانو ذرات بوسیل? اگزوپلی ساکارید به کمک آنالیز ft-ir و xrd تأیید گردید. بررسی اثر نانو ذرات cuo پوشیده شده با اگزوپلی ساکارید بر روی e. coli ptcc1336 و s. aureus ptcc1113 سمیّت کمتری در مقایسه با نانو ذرات cuo نشان داد. نتایج پیشنهاد می کند که پوشانده شدن نانو ذرات بوسیل? اگزوپلی ساکارید تولید شده بوسیل? باکتری ها می تواند یک مکانیسم احتمالی مقاومت در برابر این ذرات باشد. به منظور بررسی فعالیت آنتاگونیستی لاکتوباسیل ها علیه سودوموناس آئروژینوزا از 4 گون? لاکتوباسیلوس کازئی، لاکتوباسیلوس پلانتاروم، لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و لاکتوباسیلوس برویس استفاده گردید. برای این کار کشت عاری از سلول لاکتوباسیل ها در محیط mrs فراهم گردیده و فعالیت ضدمیکروبی آنها بر روی سودوموناس آئروژینوزا به روش انتشار در آگار به کمک چاهک بررسی شد. پس از این که مشخص شد کدام لاکتوباسیلوس بیشترین اثر ممانعت کنندگی را دارد، قسمت های مختلف کشت آن مثل کشت کامل باکتری دارای cfu/ml 106، شیراب? اسیدی، شیراب? خنثی شده و سلول های شسته شد? لاکتوباسیلوس که در بافر نمکی با غلظت cfu/ml 106 سوسپانسیون گردیدند، فراهم شده و فعالیت ضد میکروبی آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین تأثیر این بخش ها بر روی تولید بیوفیلم توسط سودوموناس آئروژینوزا نیز آزمایش گردید. نتایج نشان داد که هیچ گونه سلول زند? سودوموناس آئروژینوزا بعد از کشت در برابر نمون? شیراب? اسیدی و کشت کامل لاکتوباسیلوس برویس مشاهده نشد. در مقایسه با سودوموناس آئروژینوزای رشد کرده در محیط lb، نمون? کشت کامل و شیراب? اسیدی لاکتوباسیلوس برویس اثر ممانعت کنندگی معنی داری بر روی تولید بیوفیلم داشتند. با توجه به نتایج این پژوهش می توان بیان نمود که خاک های آلوده به فلزات سنگین منابع بالقوه ای برای جداسازی سویه های مقاوم به فلزات سنگین و نانواکسیدهای فلزی می باشند و درک اساس ژنتیکی مقاومت به فلزات سنگین در باکتری ها می تواند به استفاد? بهتر از این مکانیسم های طبیعی جهت بهبود محیط زیست هم? موجودات زنده منجر شود.